饮食乳化剂羧甲基纤维素的随机对照饲养研究

  这些结果支持了在加工食品中普遍的使用CMC可能通过改变肠道微生物组和代谢组而导致一系列慢性炎症性疾病发病率增加的观点。

  背景&目标：流行病学和小鼠研究表明，膳食乳化剂促进了与微生物群失调相关的疾病的发展。虽然这些化合物对肠道微生物群和肠道健康的不利影响已在动物和体外模型中得到证实，但这些食品添加剂对健康人类的影响仍不清楚。

  方法：为了在人类中检验这一概念，我们对都会存在的合成乳化剂羧甲基纤维素（CMC）进行了双盲对照饮食研究，其中健康成人连续11天仅食用无乳化剂饮食（n = 9）或每天添加15 g CMC（n = 7）的相同饮食。

  结果：与对照受试者相比，食用CMC会适度增加餐后腹部不适和肠道菌群组成紊乱，以此来降低其多样性。此外，饮食CMC的受试者表现出粪便代谢组的变化，特别是短链脂肪酸和游离氨基酸的减少。此外，我们确定了2名饮食CMC的受试者，他们表现出微生物群侵入通常无菌的内粘液层的增加，这是肠道炎症的一个主要特征，并且微生物群组成发生了明显变化。

  结论：这些结果支持了在加工食品中普遍的使用CMC可能通过改变肠道微生物组和代谢组而导致一系列慢性炎症性疾病发病率增加的观点。

  译名：饮食乳化剂羧甲基纤维素的随机对照饲养研究揭示了其对肠道微生物群和代谢组的不利影响

  我们招募了16名受试者，根据缺乏疾病史或代谢综合征的现有证据（见方法），他们被随机分配到含有CMC（n = 7）或对照（n = 9）的饮食中，研究者和受试者均对分配不知情（图1A和表S1）。两组在年龄、性别、体重指数和血压方面相似（图1B）。

  在筛选时，两组受试者均使用主坐标分析（PCoA）显示相似的饮食，以可视化受试者在研究登记时提供的各种食物回忆反应（图S1）。在研究第4-14天，所有受试者食用3份布朗尼蛋糕和3份冰糕，每份中不含或含有2.5 g CMC。两组受试者的体重均下降约1 kg并在血糖控制方面有适度改善，两组之间的改善程度无显著差异，但CMC饮食组的血清胰岛素水平略有下降（图1C-D）。CMC的摄入与严重不良事件或血清炎症细胞因子水平的改变无关，也不会对食欲、食物消耗或腹胀产生非常明显影响（图1E和S2）。

  此外，已用作肠道通透性间接测量的抗脂多糖和抗鞭毛蛋白IgG抗体的水平在对照或CMC饮食的受试者的研究过程中没有变化（图S3）。CMC的摄入确实与餐后腹痛的适度明显地增加相关（图1F，P= 0.019）。

  A，在摄入CMC之前、期间和之后进行日常监测和样本采集的住院研究示意图，以及口服葡萄糖耐量试验、肠活检和粪便采集的时间。

  D-F，饮食乳化剂CMC摄入量对体重（D）、PROMISE胀气/腹胀（E）和腹痛（F）评分的影响，在干预前和干预后测量。

  OGTT，口服葡萄糖耐量试验。使用Mann-Whitney检验确定显著性；*P 0.05与对照组相比。

  通过16S rRNA基因测序对每日收集的粪便样本的微生物群组成进行表征。与之前的研究一致，样本之间成对距离（未加权的UniFrac）的PCoA显示受试者内部存在强烈的聚类，表明肠道微生物群组成的个体间差异程度超过了饮食短期改变的影响（图2A，Permanova P= .001）。因此，作为关注CMC对每个受试者的潜在影响的一种方法，个人会使用在第4天上午采集的样本，即受试者在研究中开始服用CMC的那一天，对所有微生物群组成数据来进行归一化。该方法显示，在干预期间饮食CMC的受试者的微生物群组成发生了更大的变化，导致PCoA图在食用CMC 10天后显示出明显的基于处理的聚类（图2B，Permanova第0天P= 0.928，第9天P= 0.228，第14天P= 0.002）。此外，对从第4天早上开始的Bray-Curtis距离变化的分析显示，与对照组相比，CMC组在干预期间的微生物群变化趋势更大（图2C，P= .102）。这些微生物群组成的相对变化在对照组和CMC组之间的每日粪便重量（图S4）或粪便细菌密度没有显著变化（图2D，饮食效应P= 0.503）。在干预期间，门和目水平分析未显示CMC组和对照组之间有显著差异（图S5）。对CMC组和对照组之间差异最显著的序列变异（SVs）的调查显示，与第4天相比，对照组受试者在第14天的SVs普遍稳定，相对值非常接近1（图S6），而这些SVs的相对丰度受CMC消耗量的显著影响，包括普氏栖粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）和瘤胃球菌（Ruminococcus sp.）的减少，以及罗斯氏菌（Roseburia sp.）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）的增加（图S6）。虽然很难将功能性后果可靠地归因于这些改变，但我们注意到，食用CMC会导致普氏栖粪杆菌的损失，这与健康有关，并且已知会介导有益代谢物的产生，如短链脂肪酸。

  CMC还降低了微生物群的丰富度，这是各种疾病状态的标志，如均匀度（图2E，饮食效应P= 0.070，第9天P= 0.059，第14天P= 0.032）和Shannon指数（饮食效应P= 0.151，第14天P= 0.091）的降低所示。为了进一步研究CMC对微生物群组成的影响，我们接下来对饮食CMC前10天或之后不久（分别为第4天和第14天）收集的粪便样本做鸟枪宏基因组测序。质量过滤读长被分配到分类群和功能。使用Bray-Curtis距离的PCoA分析来比较受试者聚类中所有样本在分类和功能上的差异（图3A和S7A），反映了使用16S rRNA基因序列数据观察到的模式。尽管如此，根据分类法（图S7B-C），尤其是基于功能的分析（图3B-C，Bray-Curtis距离的PCoA分析），对照组和CMC饮食组受试者的样本在处理后仍存在很明显的聚类。通过Maaslin2确定的驱动此类聚集的显著改变的功能类别包括多种微生物代谢途径，表明CMC诱导的微生物群组成改变可能对微生物群功能产生广泛影响（图3D）。

  A，通过16S rRNA基因测序评估的研究参与者微生物群的未加权UniFrac距离矩阵的主坐标分析。所有时间点都包含在表示中，样本由参与的人着色。

  B，根据第4天的值对每个SVs进行标准化后，研究参与者微生物群组成在第0、9和14天的Bray-Curtis距离矩阵的主坐标分析，样本按组着色。

  C，每组微生物群落结构随时间的变化，通过从第4天到随后几天的Bray-Curtis距离测量。

  E，在第0、9和14天，CMC干预组与对照组的均匀度和Shannon α多样性测量值的变化。使用双向方差分析对Bonferroni后检验（E图）、多重t检验（E图）或PERMANOVA分析（A-B图）的多次比较进行校正，以确定显著性。

  图3. 羧甲基纤维素摄入对粪便宏基因组的影响。A，通过鸟枪测序评估研究参与者宏基因组（uniref90类别）的Bray-Curtis差异的主坐标分析。第4天和第14天包含在表示中，样本由参与的人着色。B-C，研究参与者宏基因组在第4天（B）和第14天（C）的Bray-Curtis距离矩阵的主坐标分析，通过鸟枪法测序评估，样本按组着色。

  为了研究CMC对微生物群影响的功能性后果，我们第一步检测了粪便中已知介导宿主微生物群相互作用的分子水平。使用TLR4和TLR5报告细胞分别显示，饮食CMC不会影响粪便中脂多糖和鞭毛蛋白的水平（图4A，B，Bonferroni多重比较试验的混合效应分析，4A的饮食效应P= 0.413，4B的饮食效应P= 0.220，Bonferroni校正了所有天数的P0.1）。粪便lipocalin-2（一种炎症标志物）的水平没有显著变化（图4C，Bonferroni多重比较试验的混合效应分析，饮食效应P= .258，Bonferroni校正P1，所有天数）。接下来，我们试图广泛地研究CMC改变粪便代谢组的程度，粪便代谢组既受肠道微生物群的影响，又介导其对宿主的许多影响。个人会使用了一种基于1H NMR的靶向分析，能够定量测定健康人粪便中可靠检测到的约40种代谢物，其中许多代谢物可能受到肠道微生物群的影响。

  总体而言，微生物群代谢功能的人际异质性远小于物种组成的异质性，我们比较了对照组和CMC饮食受试者之间的粪便代谢组，未进行标准化以纠正受试者之间的基础差异。因此，在饮食CMC之前（第4天），研究组的粪便代谢组无显著的聚类（图4D，Permanova第0天P= 0.573）。相比之下，在饮食CMC后，这种方法显示出明显的区分对照与CMC喂养受试者的粪便代谢组的能力（图4D，Permanova第9天P= 0.001，第14天P= 0.001）。同时，在第14天显示每个受试者的每个代谢物的个体值（图S8），以及通过热图查看各组随时间的平均值（图4E），表明CMC饮食的受试者的粪便代谢组平均耗尽了一系列微生物群相关的代谢物，包括短链脂肪酸和必需氨基酸。在开始饮食CMC后3天内，这些变化很明显，在整个饮食CMC期间保持不变，并且在大约1个月后（第48天）对受试者重新取样时，这些变化已经消失（图4E）。

  此外，基于NMR的粪便氨基酸浓度检测表明，粪便中大量氨基酸的数量减少，如图S9所示。尽管粪便细菌密度（图2D，调整后的P= 0.503）或每个受试者产生的总粪便质量没有显著差异（图S4，对照组的组内粪便重量变化P= 0.903，CMC组的组内粪便重量变化P= 0.990），但CMC受试者粪便中代谢物的消耗发生了，反对它反映了细菌的损失或粪便稀释。CMC也没有直接抑制基于NMR的氨基酸检测（图S10），这表明这些代谢物的减少并不反映技术上的人的因素，而是CMC饮食耗尽了一系列与微生物群相关的代谢物。

  A，用HEK-TLR4报告细胞测量的从第0天到随后几天粪便中生物活性LPS水平的变化。

  B，用HEK-TLR5报告细胞测量的从第0天到随后几天粪便中生物活性鞭毛蛋白水平的变化。

  C，从第0天到随后的几天，粪便中炎症标志物Lipocalin-2水平的变化。

  D，研究参与者粪便代谢组在第0、9和14天的Euclidean距离的主坐标分析，样本按组着色。

  F，在对照组和CMC处理组中，从第0天到随后的几天，粪便中羧甲基纤维素水平的变化。

  使用双向方差分析(Bonferroni post-test)或重复t检验（用假发现率方法对panel G进行校正）对多个比较进行校正，从而确定显著性；*P 0.05与图F的对照组相比，*P0.05与图G的第0天相比。

  使用放射性标记CMC进行的动物研究表明，大多数标记在粪便中被消除了，表明该化合物吸收不良。因此，我们开发了一种新的基于1H NMR的分析方法，该方法检测到接受含CMC饮食的受试者粪便中含有大量看似完整的CMC，并与食用对照饮食的受试者和正常饮食的受试者进行了比较（图4F和S11）。虽然通过本试验测得的CMC非零水平可能反映了背景（即，另一种具有类似CMC光谱特性的粪便代谢物），但食用无添加剂饮食的参与者的水平明显降低（除第13天外的所有时间点P0.05），并在研究后第48天和第107天的后续增加表明，读数捕捉到了参与我们研究之前或之后食用的加工食品中所含的CMC（图4G）。

  进一步符合CMC不被吸收的观点，在尿液中无法检测到CMC，尿液代谢组的改变也与CMC的摄入有关（图S12）。因此，我们的结果与CMC未被吸收但显著改变宿主-微生物群关系的观点一致。

  一系列慢性炎症疾病（包括IBD、代谢综合征和癌症）中宿主微生物群相互作用改变的一个特征是肠道微生物群侵入通常接近无菌的内部粘液层。因此，我们假设，我们假设CMC的摄入可能会引起微生物群减少细菌-上皮距离，这是通过共聚焦显微镜在干预期之前或之后收集的Carnoy溶液中保存的远端结肠活检中测量到的。平均而言，对照组或CMC组的细菌上皮距离在研究过程中没改变。然而，CMC组中的2名个体受试者显示该参数明显降低，因此他们的活检显示CMC暴露后细菌非常接近上皮（图5A和S13），这让人想起了在IBD患者中所做的观察。应用Fisher精确检验观察到，在研究过程中，7名CMC饮食的受试者中有2名和9名对照受试者中有0名表现出这种表型变化，得出的双尾P值为0.175，虽然不符合统计显著性的一般标准，但仍表明其有合理的可能性是CMC处理的结果。

  因此，我们检测了是否有任何临床和/或微生物群参数可以让我们深入了解这些看似CMC敏感的受试者。尽管这些受试者在临床参数或炎症标志物方面没有不同的反应，但相对于CMC组中的其他参与者，他们在饮食CMC后的微生物群组成的相对变化明显更大（图5B-C，组效应P= 0.004）。此外，这些受试者的粪便LPS水平非常明显升高（图5D，组效应P= 0.005）。使用Bray-Curtis距离的β多样性检测对功能水平的宏基因组数据来进行分析后发现，相对于CMC组的其他参与者，这两名参与者在CMC摄入后的微生物群功能相对变化明显更大（图5G，P= 0.0002）。

  临床试验开始时进行的形态特征分析表明，CMC敏感受试者均为男性，与CMC组的其他成员相比年龄较大，没有一点其他显著差异（体重、身高、BMI、SBP、DBP，图5H）。总的来说，这些根据结果得出，一些个体可能因摄入CMC而易发生宿主微生物群相互作用的改变，未来的研究有必要调查对肠道健康的长期影响。

  A，膳食乳化剂CMC摄入对微生物群定位（最近细菌与上皮表面的距离）的影响，在干预前和干预后测量。

  B，对于来自CMC处理组的每个研究参与者，从第4天到随后的几天，Bray-Curtis距离矩阵的变化。

  D，用HEK-TLR4报告细胞测量的从第0天到随后几天粪便中生物活性LPS水平的变化。E，用HEK-TLR5报告细胞测量的从第0天到随后几天粪便中生物活性鞭毛蛋白水平的变化。

  F，从第0天到随后的几天，粪便中炎症标志物Lipocalin-2水平的变化。

  G，通过 Bray-Curtis距离测量的膳食乳化剂CMC摄入对粪便宏基因组的影响。

  H，研究开始根据CMC敏感性状态对研究参与者进行生物形态学表征。使用单向方差分析校正了Bonferroni后检验的多次比较（图A和G）或双向方差分析校正了Bonferroni后检验的多次比较（图C、D、E和F）。

  20世纪中期以后，慢性炎症疾病发病率的增加与高度加工食品的消费量的增加大致相当，长期以来一直暗示此类食品的某些成分可能会促进炎症。对肠道微生物群在驱动炎症中的作用的认识导致人们对能够扰乱宿主-微生物群关系的食品添加剂产生兴趣。我们以前的研究发现，一些饮食乳化剂可以在体外和动物模型中影响微生物群，从而促进炎症性疾病，这表明这些化合物可能是这一概念的一个具体例子。然而，这些物质在多大程度上实际增加了人类食用的剂量和频率的疾病风险，仍然不太清楚。

  我们的研究根据结果得出，食用一种普遍的使用的食品添加剂，即合成乳化剂羧甲基纤维素（CMC），以一种看似有害的方式影响人类的微生物群，这是填补这一知识空白的一步。

  基于流行病学的食品添加剂研究在评估特定食品添加剂后果方面的能力有限，原因很多。首先，这些成分在商业制备的食品中的浓度并没有被广泛的报道，这使得定量估计人类的食品添加剂消耗量极具挑战性。此外，加工食品通常含有多种潜在有害成分，这使得关联的驱动因素难以识别。

  由于需要长时间的随访，评估食品添加剂对疾病发病率影响的随机对照试验很具有挑战性。尽管如此，它们仍然是鉴定特定影响成分的换黄金标准手段，例如人工甜味剂。事实上，控制饮食研究，如我们的研究，是在严控的环境下研究人类对短期饮食暴露的生理反应的理想方法。我们的设计使我们也可以关注与慢性病相关的微生物群变化，其中已经提出了因果关系。我们观察到肠道微生物群、粪便代谢组的显著变化，以及在一部分参与者中，微生物群侵占了肠道上皮。CMC饮食后粪便代谢组的主要变化是据称有益代谢物的损失。我们大家都认为这种变化可能反映了关键分类群的丧失和/或微生物群落内稳态的普遍破坏。我们还证明，能够最终靠量化粪便中的CMC水平来测定CMC的摄入量，从而提供了一种工具来促进长期研究，以解决CMC暴露在发达国家促进慢性病日益流行的程度。

  本研究中使用的CMC剂量（15 g/人/天）可能超过大多数人的CMC摄入量，但可能接近饮食主要由含有大量乳化剂的高度加工食品组成的人的乳化剂消耗总量，其中许多似乎对体外培养的人类微生物群产生不利影响。虽然本研究集中在一种特定的食品添加剂CMC上，但获得的结果支持了将这一范式应用于其他低浓度饮食乳化剂及其混合物的必要性，从而更好地模拟其在加工食品中的使用。此外，我们大家都认为重要的是要识别乳化剂在体外对人体微生物群的高度异质性影响在体内的重现程度。

  最后，虽然我们的研究未曾发现CMC敏感/CMC不敏感的参与者，但我们的根据结果得出，微生物群对这种食品添加剂的反应可能是高度个性化的。虽然需要后续研究来更好地了解这种个体间的差异性，并评估其在驱动微生物群介导的疾病状态中的作用，但我们的发现认为，特定的食品添加剂可能会扰乱宿主-微生物群的关系，从而促进个体亚群中的疾病。如果我们的结果在长期随访的大型研究中得到证实，那么确定的机制可能会为健康的食物选择提供信息，并促进更健康的加工食品的开发。