山柰挥发油自微乳化颗粒的制备与评价

  的根茎，又名沙姜、三柰、山辣等，性温热，味辛辣，可行气、温中、止痛，常用于胸腕胀满、腹中冷痛、寒湿吐泻、牙痛及风湿痹痛等证。山柰不仅是岭南地区常用的食材调味料，民间还常用其治疗消化不良、胃肠炎、风湿性疾病、关节骨折等。现代药理学研究表明，山柰挥发油具有抗菌、抗氧化、抗炎、镇痛等药理活性。然而，山柰挥发油易挥发、不稳定，难溶于水，直接给药生物利用度低，不利于药理作用的发挥，导致其在临床上未能被广泛且高效应用。

  自微乳化给药系统（self-microemulsifying drug delivery systems，SMEDDS）是油、亲水性乳化剂和助乳化剂的均一液体，具有热力学稳定性，在胃肠道和温和搅拌下可自发乳化成粒径小于100 nm的液滴[10-11]。SMEDDS具有稳定性高、黏度低、制备简单等优点，可用于提高难溶性药物的溶解度与生物利用度[12]，如白藜芦醇、葛根异黄酮、鱼腥草精油等[10,13-14]。本实验通过绘制伪三元相图、星点设计-效应面法（central composite design-response surface methodology，CCD-RSM）筛选制备山柰挥发油SMEDDS的最佳处方，并将其制备成固体颗粒进行质量评价与体外溶出度研究，以评估自微乳化颗粒有没有良好的稳定性与体外释放性。制成的自微乳颗粒不仅可改善山柰挥发油不稳定的现状，而且可使其兼具自微乳化的优势，后续还可制成片剂、丸剂或胶囊等多种剂型，有利于山柰挥发油的长期储存，方便其临床应用。

  Dionex UltiMate 3000型高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；L420-A型低速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；MS-H-pro型磁力搅拌器，美国赛洛捷克公司；Vortex Mixer QL-866型旋涡混合仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；BSA124S型万分之一天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；SHA-B型水浴恒温振荡器，上海力辰邦西仪器科技有限公司；Delos Nano C型激光粒度电位仪，美国Beckman Coulter公司。

  山柰挥发油，实验室自制；对甲氧基肉桂酸乙酯（ethyl-p-methoxycinnamate，EPMC）对照品，质量分数＞98%，批号PS020197，成都普思生物科技有限公司；司盘60、80及聚乙二醇（PEG）200、400，天津大茂化学试剂厂；甘露醇，聚维酮K30，聚山梨酯40、60、80（T80），PEG 4000、6000，上海麦克林生化科技股份有限公司；无水乙醇，天津市致远化学试剂有限公司；丙三醇，天津市百世化工有限公司；1,2-丙二醇，天津市致远化学试剂有限公司；甲醇，色谱纯，瑞典Oceanpak公司。

  固定总体系为1 g，按油相29.04%、乳化剂59.13%、助乳化剂11.82%的占比制备山柰挥发油自微乳。将乳化剂与助乳化剂涡旋混合均匀，得到混合乳化剂。随后，再将混合乳化剂与山柰挥发油涡旋混匀，形成黄色均匀的澄清液体，即得。

  2.2.1对照品溶液的制备参照《中国药典》2020年版中山柰挥发油含量检测方法[1]，以EPMC为指标成分，精密称取EPMC对照品4.20 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL，制得质量浓度为411.60 μg/mL的对照品储备液，0～4℃贮藏，备用。

  2.2.2供试品溶液的制备精密称取0.3 g山柰挥发油自微乳颗粒于10 mL量瓶中，加适量甲醇超声10 min，冷却至室温后，再加甲醇稀释至刻度，摇匀。精取5 mL至10 mL量瓶中，加入甲醇定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

  EPMC对照品色谱图见图1-a，供试品色谱图见图1-b，阴性对照（不含山柰挥发油自微乳颗粒）见图1-c。

  2.2.4线性关系考察精密吸取EPMC对照品储备液，用甲醇逐步稀释成411.60、329.28、246.96、164.64、82.32 μg/mL系列质量浓度的工作液，进样分析。以EPMC质量浓度（C）对其峰面积（A）绘制标准曲线，所得线性回归方程为A＝0.310 5 C－0.037，r2＝0.999 9，可见EPMC质量浓度在82.32～411.60 μg/mL线性关系良好。

  2.2.5精密度考察配制供试品溶液，按“2.2.3”项下HPLC法进样测定，1 d内连续测定6次，并连续测量3 d，记录EPMC的峰面积数值，计算样品日内和日间峰面积的RSD值，其结果分别为0.05%与0.72%，表明仪器拥有非常良好的精密度。

  2.2.6重复性考察平行制备6份供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件测定峰面积，计算EPMC的质量浓度和RSD。结果显示样品EPMC质量浓度的RSD值为0.22%，表明该方法重复性良好。

  2.2.7稳定性考察配制供试品溶液，室温储存24 h，期间分别于0、2、4、8、12、24 h取样，测定样品含量，结果显示EPMC供试品溶液在24 h内峰面积的RSD为0.76%，表明该供试品溶液放置24 h仍保持良好的稳定性。

  2.2.8加样回收率考察取1 mL已测定质量浓度的供试品溶液，加入等量的质量浓度为98 μg/mL的EPMC对照品溶液，用甲醇溶解至一定体积，同法制备6份，进样分析，结果显示EPMC的平均加样回收率为99.33%，RSD值为0.96%，小于1%，表明该法准确度高且回收率好。

  2.3.1辅料初步筛选将山柰挥发油与不同乳化剂或助乳化剂按照1∶4的比例涡旋混匀，随后将其以3000 r/min的转速离心2 min，观察两者的互溶情况。静置24 h后，再次观察，以出现分层和浑浊为临界指标评估互溶情况。其中所用乳化剂与助乳化剂及其互溶情况详见表1。根据互溶结果，实验初步选用T80、司盘80-T80（6∶4）、司盘80-T80（4∶6）、司盘80-T80（2∶8）为乳化剂；无水乙醇、PGE 200和PEG 400为助乳化剂。

  2.3.2助乳化剂的筛选根据油相与辅料的互溶结果，固定体系总质量为1 g，乳化剂为T80，乳化剂与助乳化剂的质量比（Km）为2∶1。将乳化剂和助乳化剂按比例混合均匀得到混合乳化剂，然后将其与油相以不同比例涡旋均匀，逐滴加入蒸馏水，记录体系临变的加水量，以三相的百分质量比作为相图的3个顶点绘制伪三元相图。以相图中自微乳面积大小为指标，考察无水乙醇、PEG 200和PEG 400 3种助乳化剂对自微乳区面积的影响，筛选助乳化剂。绘制的伪三元相图如图2所示，无水乙醇的成乳面积大于另外两者，说明无水乙醇协助形成自微乳的效果更好，因此，选其作为处方中的助乳化剂。

  2.3.3乳化剂的筛选选定助乳化剂为无水乙醇，固定Km＝2，根据油相与辅料的互溶结果，制备不同比例的混合乳化剂，将其与山柰挥发油以9∶1～1∶9的质量比涡旋混匀，直至形成黄色均匀的澄清液体。取0.1 mL至100倍量的37℃蒸馏水中，100 r/min低速搅拌，观察自乳化情况并按表2进行评分。不同乳化剂自乳化的结果见表3，由此可看出，T80所获得A等级最多，其乳化效果明显好于不同配比的司盘80-T80，因此，选定T80作为自微乳处方的乳化剂。

  2.3.4Km值范围和油相用量范围选择通过实验已初步确定自微乳处方由山柰挥发油（油相）、T80（乳化剂）及无水乙醇（助乳化剂）组成，但最佳比例还需进一步确定。将T80与无水乙醇按照5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2的Km混匀，后续操作按“2.3.3”项下方法进行。将乳化等级A和B确定为自微乳的可形成区域，以山柰挥发油（油相）、T80（乳化剂）及无水乙醇（助乳化剂）作为3个顶点，采用Origin 8.0软件绘制伪三元相图，进一步确定处方中自微乳的可形成区域。不同Km值下乳化情况如表4和图3所示。Km≥3时，其乳化情况较好。根据相图中乳区面积大小并综合考虑乳化效果，实验将Km的范围限定为3～5。油相的百分含量在10%～40%时，可乳化得到均一、透明的自微乳，且由于油相为药效成分，需保证一定含量才能发挥其药理作用，因此，将处方中油相的使用范围限定为20%～40%。

  在明确了处方的构成以及比例范围，即油相的质量分数（X1）为20%～40%，T80与无水乙醇的质量比（Km，X2）为3～5之后，本实验以微乳粒径（Y）作为考察指标，通过CCD设计优化处方，实验设计的因素水平见表5。

  按照软件设计出的方案分别制备自微乳，取0.1 mL加入100倍的双蒸水中，使用磁力搅拌器搅拌均匀，制得山柰挥发油自微乳水分散溶液，用激光粒度电位仪分析制剂的粒径，结果见表5。

  采用Design-Expert 11软件，对表5结果进行非线性回归（二项式公式）拟合，拟合方程为Y＝120.23＋48.44X1－15.74 X2＋6.53X1X2－18.57 X12－9.02 X22，R2＝0.970 9，P＜0.01，拟合方程相关系数R2＞0.9，说明采用模型拟合效果较好。对拟合方程进行方差分析，结果见表6，结果表明，显著性水平P值小于0.01，模型结果具有统计学意义。

  根据确定的最佳拟合方程，用Design-Expert 11软件绘制三维响应面图。分别固定油相、乳化剂和助乳化剂质量比Km中1个变量，观察粒径的响应面图和等高线个变量的关系。由图4可知，软件分析优化出制备山柰挥发油自微乳的最佳条件为油相占比29.04%，乳化剂占比59.13%，助乳化剂占比11.82%，预测出该最优处方的粒径理论值为90.00 nm。

  3批自微乳样品，并测定其粒径大小，结果如表7所示。3次平行测定的自微乳的粒径结果与模型预测值之间的偏差值（deviation，DEV）均小于5%，说明本实验拟合出的山柰挥发油自微乳处方具有较高的可信度。

  山柰挥发油自微乳化颗粒的制备本实验选取了醇类作为助乳化剂，在制成软胶囊内容物时易导致脂溶性药物的沉淀，故需将其制备成固体自微乳（self-microemulsion solids，S-SMEDDS）。在综合考虑了PEG 4000、PEG 6000和甘露醇3种吸附材料的性质和最大吸附量之后，发现前两者吸湿性较强，易使粉末吸潮变湿结块，作为胶囊内容物容易软化明胶壳。因此，后续实验采用吸附能力较高且无吸湿性的甘露醇作为可溶性的固体吸附材料。

  S-SMEDDS处方为山柰挥发油自微乳30 g，甘露醇58 g，蔗糖19 g。采用湿法制粒法，制软材、过筛（16目）后，于45℃烘箱中干燥8 h，整粒后，得100 g颗粒剂，按5 g/袋密封包装[15-16]。

  SMEDDS（图5-a）呈淡黄色，制得的颗粒（图5-b）外观饱满，颜色均一，无黏连。颗粒溶解后，无沉淀，溶液泛有蓝色乳光，可观察到丁达尔现象（图5-c）。

  微乳类型鉴别与自乳化速率测定称取0.5 g自微乳颗粒2份，分别置于透明西林瓶中，加入5 mL蒸馏水并用磁力搅拌器搅拌，使其分散均匀。分别向2瓶微乳液中加入水溶性染料亚甲蓝粉末（蓝色）和油溶性染料苏丹红粉末（红色），观察扩散速度，以此判断形成的微乳类型。鉴别结果如图6所示，可看到水溶性的亚甲蓝在微乳中迅速扩散，而油溶性的苏丹红在微乳中并无扩散，该结果表明微乳类型为水包油型（O/W）。

  本实验采用目测法，以自乳化的用时判断SMEDDS自乳化能力。分别称取自微乳颗粒6份，每份1 g，加20倍量的水，于37℃水浴中磁力温和搅拌下混匀形成微乳，从自微乳颗粒与水面刚接触时开始计时，当形成澄清透明、无沉淀的乳液后停止计时，记录自乳化的时间。山柰挥发油自微乳颗粒的乳化时间为（37.02±2.95）s，由此可见山柰挥发油自微乳颗粒乳化速度快，乳化能力好。

  2.5.3粒径及ζ电位的测定取0.3 g自微乳颗粒，用水稀释100倍并搅拌均匀。使用激光粒度分析仪测定微乳液的粒径、多分散系数（PDI）和ζ电位。山柰挥发油自微乳颗粒微乳液平均粒径为（89.11±1.74）nm，总体粒径分布在10～120 nm，PDI值为0.252±0.090，小于0.30，ζ电位为（−11.71±1.23）mV，说明山柰挥发油颗粒微乳液拥有非常良好的分散性能且粒径分布均匀。

  2.5.4初步稳定性考察取山柰挥发油S-SMEDDS装于密封袋中，于室温条件下保存30 d，于0、1、3、7、10、20、30 d取样，观察其外观，并测定其粒径分布以及EPMC含量，考察其稳定性。由表8结果可知，山柰挥发油S-SMEDDS在储存30 d内稳定性良好，粒径和含量变化较小，均符合要求。

  体外溶出度测定将自微乳颗粒装入硬胶囊壳中（每粒约含5.90 mg EPMC），用水浴恒温振荡器，以蒸馏水，0.1 mol/L盐酸溶液，pH 6.8磷酸盐缓冲液（PBS）各50 mL为溶出介质，振荡频率为100 r/min，分别在0、2、5、10、20、30、45、60 min时，取溶液1 mL，同时补充等量的介质，0.45 μm微孔滤膜过滤后，取滤液20 μL，按“2.2.3”项色谱条件进样分析，记录峰面积。同样方法测定等量山柰挥发油颗粒的体外释放情况。结果（图7）显示，山柰挥发油自微乳颗粒胶囊30 min内可释放90%以上，而60 min内山柰挥发油颗粒胶囊的溶出度仍小于30%，说将制成自微乳颗粒有利于山柰挥发油的溶出，且溶出介质对二者的溶出度无显著性影响。

  [17]，山柰挥发油的难溶性不仅使其生物利用度大大降低，也限制其在临床上广泛应用。

  SMEDDS。在自微乳的形成过程中，油相、乳化剂的种类以及乳化剂和助乳化剂之间的质量比都是关键影响因素，因此，选择适宜的辅料是成功制备SMEDDS的关键[18]。药用微乳要求所用辅料乳化效果好，毒性低、且亲水亲油平衡值较高，同时尽可能地减少用量[19]。出于以上考量，本研究先通过溶解度实验，考察山柰挥发油与不同乳化剂和助乳化剂的混合状态，筛选适宜的辅料。初步选用T80、司盘80-T80（6∶4）、司盘80-T80（4∶6）、司盘80-T80（2∶8）为乳化剂；无水乙醇、PGE 200和PEG 400为助乳化剂。

  T80）和助乳化剂（无水乙醇），并得出两者质量比的优化范围为3∶1～5∶1，油相的限定范围为20%～40%。最后通过星点设计实验，在考虑载药量和自微乳粒径的基础上，优选最佳处方，确定自微乳处方为油相29.04%，乳化剂占59.13%，助乳化剂占11.82%。为了提高药物的稳定性，方便携带与贮存，以甘露醇和蔗糖（3∶1）为吸附剂，制备得到山柰挥发油自微乳化颗粒。

  ζ电位，一般认为，粒径越小的药物，越利于药物的释放与吸收[20]，ζ电位绝对值越高，乳滴间斥力越大，体系就越稳定[21]。此外，目前多将液体SMEDDS作为药物中间载体，灌封于软胶囊壳中，但软胶囊剂容易发生壳体老化、药物渗漏和沉淀等问题。而加入适宜的赋形剂，再经过一定的制剂方法，将液体自微乳制备成固体自微乳系统，如片剂、丸剂、颗粒剂等，既改善药物难溶的现状，又方便贮存、运输和患者用药[22-24]。

  O/W）乳液。在室温下密封避光储存30 d，粒径和含量无明显变化，其胶囊在30 min可释放90%以上药物，而山柰挥发油颗粒60 min的溶出度不足30%，表明该固体自微乳系统拥有非常良好的分散性、稳定性和溶出度，质量良好，可为其开发与临床应用提供科学依据。